16 juin 09
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Beaucoup d'expériences en biochimie exigent une ou plusieurs étapes de centrifugation. Cette technique permet d'exposer des échantillons à de fortes accélérations qui permettent la séparation des constituants. On peut ainsi fractionner une préparation en un sédiment (ou "culot"), constitué de matériel plus ou moins solidement entassé dans le fond du tube à centrifuger, et en un surnageant qui sera le liquide résiduel au dessus du sédiment.
PRINCIPES DE BASE
Une particule soumise à un champ gravitationnel tend à se déplacer dans ce champ jusqu'à ce qu'elle rencontre une résistance capable de l'arrêter complètement. Ce principe fondamental de physique est très utilisé en biochimie pour séparer des précipités, des cellules, des organites et même des macromolécules. En mettant une préparation biochimique dans le rotor d'une centrifugeuse et en faisant tourner celui-ci, on génère une accélération qui va pousser les particules qui la composent vers l'extérieur du rotor, c'est-à-dire le fond du tube à centrifuger. La vitesse avec laquelle se déplaceront ces particules est proportionnelle à
- la force gravitationnelle à laquelle la particule est soumise
- la masse de la particule
- la différence entre la densité de la particule et celle du solvant,
et inversement proportionnelle à
- la friction avec le milieu, en fonction de la taille et à la géométrie des particules.
Une particule donnée (e.g. une sous-unité d'un ribosome) a donc une vitesse spécifique de sédimentation lors d'une centrifugation parce qu'elle a une combinaison donnée de masse, de densité et de morphologie. On exprime souvent cette caractéristique en coefficient de sédimentation, généralement exprimée en unités Svedberg (S). Plus une particule est massive ou dense ou ne génère qu'une faible friction (due à sa forme), plus son S sera élevé. Cette unité de "taille" est particulièrement employée pour caractériser les particules ribosomiques. C'est pourquoi on parle encore de ribosomes 70 S chez les procaryotes et 90 S chez les eucariotes.
On peut facilement générer une force centrifuge en faisant tourner à haute vitesse un rotor pouvant contenir des tubes à centrifuger. Une force gravitationnelle se forme alors perpendiculairement à l'axe de rotation du rotor.
MÉTHODES ET APPAREILLAGE
Centrifugeuses
La principale limite qui détermine la vitesse de rotation du rotor est évidemment la force du moteur qui le fait tourner. Plus le rotor est lourd et volumineux, plus l'effort que doit fournir le moteur est grand.
On a développé une gamme d'appareils en fonction des besoins expérimentaux, particulièrement au niveau des accélérations requises, des volumes de matériel à centrifuger, de la température de travail, etc.
Centrifugeuses de table: Les modèles les plus simples, souvent appellées centrifueuses cliniques, permettent d'atteindre de faibles accélérations (1000 à 3000 xg) à des vitesses de rotation relativement basses (moins de 3000 RPM). Certains modèles sont réfrigérés, certains autres non.
Centrifugeuses au sol: Ces appareils sont un peu plus complexes. Elles permettent d'obtenir des vitesses de rotation de l'ordre de 30 000 RPM, donnant pour les plus petits rotors des accélérations d'environ 20 000 xg. Tous les modèles sont réfrigérés. Ces centrifugeuses permettent de centrifuger des relativement gros volumes. Certains rotors peuvent même contenir quatre ou six bouteilles de 250 mL.
Ultracentrifugeuses: Ce sont des appareils complexes et coûteux qui permettent d'atteindre des accélérations très élevées (jusqu'à 300 000 xg) en faisant tourner des rotors très rapidement (50-85 000 RPM). De telles vitesses de rotation ne peuvent s'obtenir que sous pression très réduite. Les faibles pressions permettent aussi d'éviter la surchauffe du rotor et de l'échantillon. Tous les modèles sont réfrigérés. Ces appareils doivent donc être munis de pompe à vide et de systèmes de réfrigération. Les volumes sont quelques peu limités, généralement on ne trouve pas de rotors pouvant contenir plus d'une dizaine de tubes de 40 mL. Récemment, la compagnie Beckman a fabriqué un modèle d'ultracentrifugeuse tournant à 130,000 rpm générant des accélérations de plus d'un million de g! Un diagramme et une description du fonctionnement d'une ultracentrifugeuse ont été publiés récemment (JM Perkel, 2004).
Microcentrifugeuses: On a aussi développé des centrifugeuses spécialement conçues pour les micro-volumes très souvent employés en biochimie moderne. Les microtubes à centrifuger sont des petits tubes coniques généralement de 1.5 mL fait de polypropylène et assez peu dispendieux. Les centrifugeuses de ce type peuvent être réfrigérées et atteindre des accélérations de l'ordre de 12-15 000 x g. Les modèles les moins couteux n'ont pas de contrôle de vitesse et ne sont pas réfrigérés.
Ultracentrifugeuses analytiques: Ce sont des appareils de moins en moins utilisés. Ces centrifugeuses servent surtout à analyser la taille et la masse des particules et des protéines. D'autres techniques beaucoup moins coûteuses sont utilisées de nos jours: électrophorèse, filtration sur gel...
Rotors
La fabrication et la conception des rotors doivent tenir compte de nombreuses contraintes. Ils doivent être évidemment suffisamment résistants pour supporter les accélérations voulues mais suffisamment légers pour que le moteur de la centrfugeuse puisse les faire tourner à la vitesse requise.
Pour les centrifugations à faible vitesse peuvent se faire avec des rotors en acier. Cependant, pour les fortes accélérations, on utilise des alliages à base de métaux à la fois légers et résistants comme l'aluminium et le titane. Les rotors faits de matériaux composites (à base de fibres de carbone), extrêmement résistants et légers, ont même fait leur apparition depuis quelques années.
C'est pourquoi chaque rotor a une vitesse maximale à laquelle on peut les faire tourner. Il est esentiel de respecter scrupuleusement cette limite pour éviter le bris du rotor ou celui du moteur.
Une autre contrainte est la dimension du rotor. Pour maximiser la vitesse de rotation il faut minimiser le rayon du rotor, donc sa taille. Pour centrifuger de gros volumes, il faut évidemment de plus gros rotors, ce qui explique que les rotors de grande capacité ne peuvent tourner qu'à des vitesses réduites.
Il existe trois grands types de rotor: à angle fixe, à godets mobiles et verticaux.
Les rotors à angle fixe ("fixed angle") sont faits de blocs de métal (aluminium, titane) avec des puits creusés à l'intérieur et inclinés avec un certain angle par rapport à l'horizontale, généralement de l'ordre de 15° à 35° selon les modèles. Les tubes à centrifuger sont déposés dans ces puits. Comme ces rotors sont relativement compacts. Ils sont plus faciles de les faire tourner rapidement à cause de leur rayon relativement court. Les particules sédimenteront surtout le long de la paroi du tube (voir figure suivante). De plus, elles s'accumulent plutôt sur des côtés du fond du tube à centrifuger. Pour certains types de particules cela engendre une friction qu'elles ne peuvent pas supporter et se brisent. Cependant, la plupart des centrifugations à vitesses moyennes et élevées se font avec ce type de rotor.
Les rotors à godets mobiles ("swinging buckets") se réorientent lors de la centrifugation. En effet, les godets sont disposés sur des crochets ou un système à bascule. Quand la rotation du rotor débute les godets (et les tubes qu'ils contiennent), sous l'effet de la force centrifuge, se réorientent et passent en position horizontale. Les particules peuvent donc sédimenter directement dans le fond du tube sans jamais heurter les parois du tube (voir figure suivante). Elles s'accumulent dans le fond du tube à centrifuger. Le principal inconvénient de ce type de rotor est qu'il ne peut pas atteindre des vitesses très élevées comparé à l'autre. En effet, les godets en position horizontale allongent énormément le rayon du rotor, ce qui rend plus difficile de lui imprimer des vitesses de rotations élevées. Ce genre de rotor est utilisé principalement dans les centrifugation en gradients discontinus ou continus.
Sédimentation des particules (cercle noir) dans divers types de rotor Migration d'une particule dans les deux principaux types de rotor. La plus grande partie du déplacement des particules dans un rotor à angle fixe se fait le long de la paroi distale du tube, ce qui n'est pas le cas dans le rotor à godets mobiles. La position du sédiment est aussi différente: bien centrée dans le fond du tube dans le rotor à godets mobiles, décalée vers le coté distal de la paroi du tube dans le rotor à godets mobiles.
Les rotors verticaux sont beaucoup moins répandus et sont essentiellement utililisés pour les gradients de type isopicniques ou zonaux. Ils sont décrits plus en détail dans le chapitre du SIITUB sur la centrifugation en gradient de densité.
Centrifugation en gradients
On peut amplifier l'efficacité des méthodes de séparation en centrifugeant dans des gradients de densité. Ce type de méthode est décrit de façon plus détaillée dans un autre chapitre du SIITUB sur la centrifugation en gradient de densité.
Ultracentrifugation analytique
On peut déterminer avec une grande précision la masse et le coefficient de sédimentation des protéines et autres particules par ultracentrifugation analytique (UCA). Les méthodes à équilibre d'UCA permettent aussi de déterminer la masse. Cette technique exige un appareillage (centrifugeuse, rotor, etc.) spécialisé à cette fin.
APPLICATION À LA BIOCHIMIE
Séparation de phases
La séparation de deux phases liquides non miscibles qui peut être effectuée de façon beaucoup plus rapide par centrifugation. Il suffit de les centrifuger quelques minutes et la séparation se fera. Le phénol est souvent séparé d'une phase aqueuse de cette façon dans les méthodes d'extraction au phénol des acides nucléiques.
Fractionnement cellulaire
On utilise fréquemment la centrifugation différentielle pour séparer les composantes cellulaires. Évidemment les vitesses exactes et les durées de centrifugation peuvent varier en fonction du type de tissus, du tampon ou d'autres facteurs.
Typiquement, on peut sédimenter les noyaux à 1-2000 xg durant 5-10 minutes. Les mitochondries et les chloroplastes tombent à environ 10-15000 xg durant 10-15 minutes. Les "microsomes", petites vésicules produites lors de l'homogénéisation et la fragmentation des compartiments membranaires comme le golgi ou le réticulum endoplasmique, membrane plamique. etc. peuvent sédimenter après une trentaine de minutes à 15-30000 xg. Il faut comprendre que les "microsomes" ne sont pas des particules qui existent en tant que telles dans une cellule intacte. Ce sont des artefacts de la méthode du bris de la cellule. Ils contiennent néammoins le contenu enzymatique ou autres composantes des structrures cellulaires (golgi, réticulum) à partir desquelles ils sont formés.
Les ribosomes sont obtenus à 100,000 xg après 1 ou 2 heures. Le surnageant résiduel contient le matériel cytosolique. La centrifugation différentielle ne donne que des préparations grossièrement purifiées.
Séparation de particules selon leur taille ou leur densité: Ce type d'application est décrit de façon plus détaillée dans un autre chapitre du SIITUB sur la centrifugation en gradient de densité.
MANIPULATIONS ET ASPECTS PRATIQUES
Centrifugeuses et rotors
En général, les centrigugeuses n'acceptent que les rotors fabriqués spécifiquement pour elles, généralement vendus par la même compagnie. Il faut donc n'employer que les rotors spécifiquement conçus pour une centrifugeuse donnée Il est essentiel de respecter scrupuleusement cette limite pour éviter le bris du rotor ou celui du moteurÉquilibrage des tubes
Comme les rotors sont soumis à des vitesses énormes, il faut équilibrer le poids autour de son axe de rotation. En général on s'organise pour que le poids des tubes qui sont face à face dans le rotor soit identique. On parle alors d'équilibrer les tubes à centrifuger.
Pour équilibrer deux tubes (ou bouteilles) à centrifuger on peut:
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enlever du liquide dans le tube le plus lourd |
si on peut se permettre de ne pas utiliser toute la préparation et perdre du matériel |
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ajouter un solvant dans le plus léger |
si on peut se permettre de diluer la préparation |
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transférer le matériel du plus lourd au plus léger |
si les deux tubes ont le même contenu et peuvent être mélangés |
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équilibrer chaque tube contre un tube de solvant |
si on a suffisamment de place dans le rotor |
On équilibre généralement avec une balance à plateaux préalablement mise à niveau. Si les tubes ne peuvent tenir debout seuls, il faudra se servir de contenants (bécher, erlen) permettant de les maintenir suffisamment verticaux pour que le contenu ne se renverse pas lors de l'équilibrage. Dans ce cas il faudra évidemment mettre la balance à niveau avec ces contenants, puis ensuite mettre les tubes à centrifuger à équilibrer. Le cas échéant, il faut toujours équilibrer tout le dispositif qu'on met dans le puits du rotor (bouchon, adaptateur).
Si on emploie une centrifugeuse à très haute vitesse (ultracentrifugeuse, 30 000 x g ou plus), la précision de la pesée est encore plus critique. En effet une différence de 1 g sous gravité normale devient 100 kg à 100 000 x g ! Dans ce cas il est préférable d'équilibrer les tubes avec un instrument plus précis qu'une simple balance à plateau, une balance analytique, par exemple.
Les microtubes sont très difficiles à équilibrer. Dans ce cas on peut simplement mettre face à face des tubes contenant un volume identique. Leur poids est généralement trop faible pour qu'une différence notable soit facilement perceptible avec une balance à plateau. De plus la combinaison de la faible différence de poids entre les deux tubes, les faibles accélarations obtenues et la relative solidité du rotor rendent le plus souvent inutile un équilibrage précis.
Soin des rotors et de la centrifugeuse
Il est crucial de prendre un soin méticuleux des rotors. Comme on l'a vu précédemment, ils sont soumis à des forces extrêmes et tout phénomène, particulièrement de corrosion, qui créerait des faiblesses dans le métal. C'est pourquoi il faut nettoyer à fond tout déversement de matériel dans un des puits, les godets ou sur les parois du rotor. En effet les solutions physiologiques contiennent des sels et d'autres substances susceptibles de promouvoir la formation de corrosion. Quand un tel déversement se produit, il faut nettoyer le plus tôt possible les puits avec de l'eau et un détergent doux. Ensuite, on doit rincer abondamment avec de l'eau distillée, puis enlever toute trace résiduelle d'humidité en essuyant. Après chaque centrifugation, une inspection pour vérifier s'il y a eu un déversement et prendre les mesures nécessaires.
On devrait éviter d'uitiliser une brosse à brins métalliques qui, en égratigant le rotor créerait des points où la corrosion pourrait s'installer. De même, si un tube s'est brisé durant la centrifugation, on ne devrait pas essayer de l'enlever avec des pinces ou d'autres instruments métalliques.
De plus, quand on range un rotor au froid, on devrait le faire de telle façon qu'il ne se forme pas d'humidité dans les puits ou les godets.
CALCULS
Calcul de la force gravitationnelle relative
Dans une centrifugation, il faut connaître la force relative de centrifugation (force de gravité relative, FGR, accélération) en "x g". Cependant pour une vitesse de rotation donnée, chaque rotor a une FGR différente puisque que le rayon de rotation est différent. Il faut donc être capable de convertir la vitesse de rotation (RPM, rotations par minute) en FGR. Pour cela on peut se servir d'un nomogramme ou de la formule mathématique de conversion. Celle-ci est:
où g est la force relative de centrifugation, r est le rayon de rotation du rotor (en cm) et N (rotations par minute, RPM) exprime la vitesse de rotation. Inversement, et c'est ce qui est généralement le plus utile expérimentalement, on peut calculer la vitesse de rotation (en RPM) pour atteindre une accélération donnée:
Une formule similaire permet de faire les calculs avec les dimensions en pouces du rotor.
Selon le type d'expérience, on doit se servir de la FGR maximale, moyenne ou minimale avec respectivement le rayon au fond du tube, au milieu ou au sommet du tube à centrifuger. Cependant, lorsqu'aucune indication n'est donnée dans un protocole expérimental, on utilise le rayon au fond du tube (maximal).
L'emploi d'un nomogramme est simple. Un nomogramme des forces centrifuges se présente comme trois lignes verticales, une donnant le rayon de centrigugation du rotor (en cm ou en pouces, vérifier avant emploi), une autre la forece centrifuge relatice (en x g) et la dernière la vitesse de rotation du rotor (en RPM).
Il s'agit alors tout bonnement de relier par une droite les deux variables connues pour obtenir la troisième. Ainsi pour obtenir la vitesse de rotation du rotor, on trace une droite entre le rayon de rotation du rotor et l'accélération désirée (FGR).
Un nomogramme de taille raisonnable est disponible sous format pdf:
En général, le calcul théorique donne une valeur beaucoup plus précise et ne nécessite évidemment pas d'avoir un nomogramme sous la main.
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Exemple: Un rotor a un rayon de rotation maximal de 10 cm. A quelle vitesse faudra-t-il le faire tourner pour obtenir une accélération de 100 000 x gmax ? D'après la formule: = 29 894 soit 30 000 RPM
D'après un nomogramme: si on aligne 10 cm et 100 000 g, on intercepte la valeur d'environ 30 000 sur la ligne des RPM. |
Il est à remarquer qu'en général dans une publication ou un texte technique, on devrait donner la FGR en termes de xg plutôt que de RPM. En effet les RPM n'ont de signification qu'en fonction d'un rotor donné, puisque chaque rotor a des dimensions différentes, donc des rayons de rotation différents. Donc si on fournit la FGR en x g, chaque personne pourra calculer les RPM équivalent pour le rotor qu'elle a à sa disposition, sans avoir à chercher les dimensions du rotor utilisé par l'autre auteur.
création:98 04 28
additions: 00 04 25
04 02 26
03 12 04
RÉFÉRENCES ET BIBLIOGRAPHIE
RF Boyer (1993) Modern experimental biochemistry, Addison-Wesley Publishing Company, Reading (USA), 191-211 [présentation complète du sujet, théorie de la centrifugation et traitement mathématique, type de centrifugeuses et de rotor, principales applications, conseils sur l'emploi et l'entretien des centrifugeuses, nombreuses illustrations, nomogramme].
M Brush (1997) High Speed Centrifuges, The Scientist 11[19]:21-. [revue des principales caractéristiques des centrifugeuses à haute vitesse]
M Brush (1999) Still Spinning After All These Years: A Profile of the Ultracentrifuge, The Scientist 13[20]:16, Oct. 11, [développements récents dans le domaine des centrifugeuses et des rotors]
RL Dryer, GF Lata (1989) Experimental biochemistry, Oxford University Press, Oxford
P Kamoun (1977) Appareils et méthodes en biochimie, Flammarion, Médecine-Sciences, Paris.
M le Maire, R Chabaud, G Hervé (1990) Un modèle d'étude: l'aspartate transcarbamylase, Masson, Paris, p.66-80. [description détaillée des principes et de l'analyse des résultats de centrifugation]
JM Perkel (2004) How It Works | The Ultracentrifuge, Scientist: 18 (19):32-34 [description du fonctionnement d'une ultracentrifugeuse]
DT Plummer (1987) An introduction to practical biochemistry (3e édition), McGraw Hill Book Co., London.
Didier Gauthier
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